讓病原體無所遁形–疾病檢驗

近年來全球各地頻傳致命的傳染病,令人聞之喪膽,為了能及早發現、及早治療,快速、正確地檢驗出致病原因至關重要。到目前為止,病原體的檢驗方式有哪些呢?

 
 
 

近年來許多令人聞風喪膽的傳染病不時出現,相信臺灣的民眾都不會忘記2003年SARS肆虐的情形;原本只會感染家禽的禽流感,也頻頻傳出感染人類的案例。這些難以預測的病毒,比任何武器都強悍、可怕,因此當前有許多科學家,致力於研製消滅與預防這些致命疾病的藥劑。另一方面,為了讓這些病毒無所遁形,開發出快速、準確的檢驗試劑也是刻不容緩的工作,當然檢驗試劑的經濟價值也會隨著水漲船高。

根據美國的研究調查,在2000年全球體外診斷試劑市場已達233億美元,同時每年以約7%的幅度向上攀升。在臺灣,許多廠商也紛紛投入檢驗試劑的研發製造,光是近5年來,投入檢驗試劑領域的臺灣生技廠商就多達20家以上。檢驗試劑的種類,從疾病檢驗、驗孕、驗血型,到測試公共場所販售的飲料是否含有禁藥等。隨著人類對傳染性疾病預防監控觀念的日漸重視,檢驗試劑的需求也逐漸擴大。

傳染性疾病的檢驗,要從找出病原體開始。病原體是引起疾病的微小生物,一旦確定病患體內的病原體為何,才能對症下藥。辨識病原體和辨認一個人一樣,必須找到這個人的外型特徵,張三有鬍子,李四嘴角有個痣,藉由辨識病原體的特殊標記,就可以確認該病原體了。一般用來辨識的標記有3種型態,分別是DNA、信使RNA(messenger RNA, mRNA)以及蛋白質。我們就先從認識DNA到合成蛋白質的過程開始吧!

從基因到蛋白質

生物的遺傳物質去氧核醣核酸(DNA),是構成細胞核中染色體的基本成分,它是由磷酸根、五碳核醣與含氮鹼基所組成的。含氮鹼基有4種:腺嘌呤(adenine,簡稱為A)、鳥糞嘌呤(guanine,簡稱為G)、胸腺嘧啶(thymine,簡稱為T)和胞嘧啶(cytosine,簡稱為C)。

鹼基之間可以形成固定的配對關係,A跟T配對,G跟C配對。在染色體中,兩條DNA序列藉由這配對原則排列,構成由華生(James Watson)和克立克(Francis Crick)在1953年發表的著名雙螺旋結構。這樣的DNA結構除了可以確保遺傳訊息絲毫無誤地傳遞給下一代,也是使基因能夠發揮功能的機制。

基因要能夠發揮功能,必須根據DNA訊號合成有活性的蛋白質。細胞從DNA訊號到合成蛋白質的過程,需要經過轉錄與轉譯兩個步驟。首先基因的DNA序列先轉錄成信使RNA,兩者的關係是互相配對的。信使RNA是由核醣核酸(RNA)構成,RNA和DNA相似,也有4個不同的鹼基,不同處在RNA以尿嘧啶(uracil, U)取代T,和A形成配對,因此DNA上的A會轉錄為信使RNA上的U。

當細胞啟動某一蛋白質的基因時,DNA的雙股結構就會分開,RNA聚合酶便開始轉錄的動作,製造信使RNA。信使RNA在核醣體中做為模板,由另一個酵素把「RNA的語言」轉譯成「蛋白質的語言」。信使RNA上的序列會把每3個含氮鹼基歸為一組,每一組會轉譯成一種特定的胺基酸,根據不同的順序把胺基酸連在一起,就形成了不同的蛋白質。

不同的病原體有其特定的基因組合,再怎麼相似的病原體,也會有不同的基因。這些基因可以轉錄成特有的信使RNA,以及轉譯成專一的蛋白質。病原體入侵人體時,必然會有這些物質的痕跡,藉由檢驗每個病原體特有的DNA、信使RNA或蛋白質,就可以判斷病患感染了哪一種病原體。因此,可以利用這3種生物分子的特性,發展出檢驗各種不同疾病的利器。接下來介紹根據這3種物質而開發出來的各種檢驗方法。

DNA與RNA的檢測

DNA和RNA中鹼基間的配對關係,經常用來鑑定特殊的基因序列。其中的原理就是,先製備和檢驗病原體中特定DNA序列互補的DNA,以它為探針去搜尋欲檢驗的DNA序列。在生化的研究上經常不斷地運用這個策略,以下介紹一些目前常用的方法。

聚合酶連鎖反應 檢驗病原體經常遭遇的問題,就是病原體的數量不夠,需要數日的培養,等到病原體到達一定的數量後,才可以檢測。如此一來,曠日廢時,病情可能因此被延誤了。聚合酶連鎖反應的發明,使得我們可以大幅縮短檢驗的時間。聚合酶連鎖反應是穆里斯(Kary B. Mullis)於1983年發明的,他也因為這項發明獲得了1993年諾貝爾化學獎。

聚合酶連鎖反應可以在短時間內大量複製特定基因片段。在進行聚合酶連鎖反應前,要先加入DNA聚合酶及引子(primer)。DNA聚合酶是用來催化DNA複製反應的進行,使反應速率加快。引子是一段特定的寡核酸序列,與DNA序列中的某片段互補,用來啟動DNA的合成反應。聚合酶連鎖反應開始時要提高溫度,使DNA雙股分離,冷卻之後,引子會和剛分離的特定單股DNA序列結合。

DNA聚合酶利用單股DNA序列為模板,從引子處接上去氧核醣核酸,開始進行複製DNA序列的工作,使得基因的數目增加一倍。重複這個步驟,可以使得DNA的數目不斷倍增,直到能夠被偵測為止。

信使RNA雖然也是一種檢測病原體的標的,但是信使RNA容易分解,不像DNA那麼穩定,保存不易。這時可以利用反轉錄酶以信使RNA為模板,合成與它互補的cDNA(complement DNA),再配合聚合酶連鎖反應大量增殖cDNA序列,就可以利用少量的信使RNA檢體,偵測到病原體的存在。這個方法也稱為反轉錄聚合酶連鎖反應。

生物晶片 近來發展迅速的生物晶片,是檢測生物分子的利器。生物晶片是在小面積的基材上,完成大量生物性相關檢測的方法,具有快速、高準確度、高靈敏度、同時檢測大量樣本等優點。生物晶片通常利用玻璃片、尼龍薄膜等材料為基材,再利用精密的點陣技術,把所需檢測的大分子點置於處理好的基材上做為探針,可用來檢測DNA、RNA、蛋白質,甚至細胞等。

基因晶片是目前發展較成熟的一種生物晶片,常用於檢測病原體的DNA或信使RNA。把與病原體特殊基因序列互補的DNA,高密度地固定在基材上做為探針,利用鹼基互相配對的性質,當檢測液流過晶片時,含有與探針互補的DNA序列,就會產生連結而滯留在基材上,這項反應稱為雜合反應。

產生雜合反應後,清洗掉沒有發生雜合反應的樣本DNA,只留下和探針互補的DNA序列。由於DNA序列會事先接上可偵測的標記物,通常是螢光或放射物質,這時會有螢光或放射影像的反應,掃描後以電腦分析,就可得知待測物中是否含有實驗者所欲檢測的物質。

基因晶片的好處是可以同時檢驗數以萬計的檢體,也可以同時檢驗數十種病原體。例如,當我們感冒時有時候會發燒,引起發燒的病原體種類相當多,而每一種病原體的治療方式及用藥也不盡相同,因此判定病人的發燒由何種病原體引起,是相當重要的。

大家應該還記得在SARS期間,只要周遭有人發燒,就引起大家的恐慌,由於檢驗須花費數日,這段期間發燒的病人必須隔離,而曾經和病患接觸過的人同時也處在恐懼之中。「發燒晶片」的發明可以有效解決這個問題。在發燒晶片上,事先布植各種引起發燒的病原體DNA探針,只要取病人咽喉中黏液製作檢測樣本DNA,流過發燒晶片,藉由晶片中發亮的位置,就可以判定是何種疾病引起的發燒反應。配合聚合酉每連鎖反應及反轉錄聚合酶連鎖反應,還可以增加檢測的靈敏度。

蛋白質的檢測法

蛋白質的檢測經常是利用抗體來進行。當人體受到外來的病原體攻擊而產生免疫反應時,促使B淋巴細胞產生的抗體,可用以辨識這些外來的病原體。抗體辨識的主要目標是病原體的蛋白質,抗體可以和所辨識的蛋白質產生高度專一性的結合,就像鑰匙與鎖的關係。利用這特性,便可以開發出免疫檢驗試劑。

免疫檢驗試劑 免疫檢驗試劑,顧名思義是指利用抗體與抗原結合所產生的免疫專一性反應,定性或定量分析檢體中抗原或抗體的測試劑。目前有許多利用免疫化學原理做成的快速免疫檢驗試劑,其中包括酵素免疫分析法、酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、螢光免疫分析法、免疫沉澱和移動式免疫檢驗法等。

酵素免疫連結分析法是使用酵素標記的抗體(或抗原)來偵測的方法。這方法是先使抗體(或抗原)吸附在固相基材上,再把酵素標記物與抗原(或抗體)結合,進而產生有色的產物。偵測這酵素反應包括顏色、螢光或化學光等,利用顏色深淺來反映樣品中抗原或抗體的量,這種方法可用來偵測荷爾蒙、藥物濫用、環境污染物、傳染性疾病和微生物毒素等。

三明治免疫分析法是一種常用的ELISA檢定方式。首先把抗體甲固定在固相基質上,再加入待測樣品,這時待測蛋白質會結合在抗體甲上,其他不相干的蛋白質則不會和抗體甲結合。把其他不會吸附在抗體甲上的蛋白質清洗掉,再加入也會和待測蛋白質結合的抗體乙,則會與待測抗原形成專一性的結合。最後,加入會和抗體乙結合的「二次抗體-酵素連結體」,就使得這些酵素留在基材上。利用酵素所產生的顏色深淺來測定固相基材上所留的酵素量,就可得知樣品中待測蛋白質的量(和酵素量成正比)。

這方法的專一性極強,因為樣品進行了兩次專一性辨認(抗體甲與抗體乙),因此檢驗的準確性很高,同時靈敏度也極大。缺點是耗費時間,無法達到大眾化的快速檢驗要求。

相較於酵素連結免疫吸附分析法,其操作時除了添加待測樣品外,尚需加入其他的抗體或標記物,且需繁瑣的清洗步驟。而移動式免疫檢驗試劑,在產品製作時已預先把所有的反應試劑置於載體上,使用時不需添加任何試劑,吸入待測樣品後,就可迅速判讀結果,因此又稱為「單一步驟移動免疫檢驗法」。

這種單一步驟免疫檢驗法方便、快速,是目前檢驗試劑界應用最廣的技術,包括市面上普及的驗孕試劑、排卵試劑,以及全球生技廠商致力研發的癌症試劑、傳染病試劑、禁用藥物試劑、心臟病診斷試劑等,都是採用這套技術衍生發展而成的。

蛋白質晶片 蛋白質晶片原理與基因晶片相同,差別只在於把探針改為蛋白質,可以偵測蛋白質-蛋白質、抗原-抗體、酵素-受質間的專一性結合。把蛋白質、抗體或酵素當做探針固定在晶片基材上,和檢測樣本接觸,如果檢測樣本中含有能與探針結合的物質,就能夠發生反應。

在蛋白質晶片中,有一種可以偵測其反應結果的方法,叫做表面電漿共振法,這方法快速而且靈敏,成為近年來許多研究的重點。

所謂表面電漿共振是一種光學現象,當光束從一個介質傳導到另一個介質時,會發生反射與折射的現象。如果光線從高折射率介質進入低折射率介質,在入射角超過某個角度時,會造成全反射的現象。雖然這時不會有任何能量穿越兩種介質的交界面,但由於光束的電子振盪和金屬薄層內金屬原子產生共振作用時,光束仍會以電流的方式,向低折射率介質的方向洩漏一些能量,使得在特定的反射角範圍內,引起反射強度的急遽變化。這角度稱為共振角,它會隨著低折射率介質的折射率改變而有所變化。

表面薄膜共振法通常是在鍍金的玻璃上接上探針,當檢體經過時,如果裡面含有會和探針結合的物質,就會改變表面的折射率,進而影響共振角。藉由共振角的改變,可以偵測待測檢體中是否有能和探針結合的成分,同時共振角的改變和結合於探針上的檢體量有一定的關係,因此也可以做為定量的工具。這方法可以進行立即、連續的偵測,檢體也不需要做任何標誌。

有些疾病的病毒極易產生變異,因此病毒的種類越來越多,也讓人們更加難以捉摸。當人們受到不知名病毒感染時,如何快速準確地確定病毒種類,格外顯得重要。以上所提的各種原理,許多已應用在醫學檢驗上,有了這些檢驗試劑的開發,一旦SARS或禽流感等流行性疾病伺機而動時,就可以儘早發現、儘早治療,避免疫情擴大。另外在生技醫藥產業中,檢驗試劑的研發投資較少、進入障礙較低、回收時間較快,因此十分受到國內業者青睞,檢驗試劑的發展前途未可限量。

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